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Caracterização fisiológica e genética do transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis

Martins, Emerson Augusto Castilho

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Biociências 2011-04-06

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Caracterização fisiológica e genética do transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis
  • Autor: Martins, Emerson Augusto Castilho
  • Orientador: Winter, Lucile Maria Floeter
  • Assuntos: Fisiologia Da Relação Parasita-Hospedeiro; Transporte De Aminoácido; Amino Acid Transport; Physiology Of Host-Parasite Interaction
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Protozoários do gênero Leishmania são parasitas digenéticos, com uma fase no tubo digestório de um hospedeiro invertebrado (promastigota), e uma fase parasita intracelular de macrófagos (amastigotas). Estudar a demanda de L-arginina no parasita é interessante, uma vez que o aminoácido é indispensável para a sobrevida do parasita e, ao mesmo tempo, serve de substrato para a produção de óxido nítrico, principal composto microbicida dos macrófagos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis do ponto de vista fisiológico e caracterizar o gene que codifica o transportador do aminoácido, bem como a regulação da sua expressão em resposta a diferentes condições biológicas. Para medir o influxo de L-arginina em fagolisossomos, utilizamos macrófagos J774 infectados com L. (L.) amazonensis e desenvolvemos uma metodologia com citometria de fluxo com sorting para a purificação da organela. Validamos microscopicamente a presença do parasita na organela por sua fluorescência, e avaliamos a integridade da membrana externa dessa com marcador de pH ácido. Paralelamente, o gene que codifica o transportador de arginina do parasita foi caracterizado. Foram encontradas duas cópias em tandem que produzem dois transcritos (5.1AAP3 e 4.7AAP3), cujas regiões 5\'UTR e 3\'UTR são diferentes. Por meio de PCR quantitativo em tempo real, avaliamos a expressão desses transcritos e verificamos que 5.1AAP3 é mais expressa ao longo do desenvolvimento do parasita, com um máximo em fase estacionária. A determinação da meia-vida dos mRNA das duas cópias indicou uma duração de 32,6±5,0min para o mRNA de 4.7AAP3, enquanto que o de 5.1AAP3 não apresentou decaimento até 180min do estudo, evidenciando que a estabilidade maior pode ser a razão de sua maior abundância. A submissão de parasitas à privação de arginina levou a aumento na tomada do aminoácido concomitante ao aumento do transcrito 5.1AAP3. Mutantes nulos de arginase submetidos à privação de arginina respondem com uma taxa de incorporação mais baixa em relação aos parasitas selvagens, e mantém a resposta à privação mesmo com os parasitas em fase estacionária, diferente do observado nos parasitas selvagens. Esse conjunto de resultados nos levou a sugerir que a expressão do transportador pode ser regulada pela estabilidade do mRNA, e que o pool de arginina interno ao parasita pode controlar, num mecanismo de retroalimentação negativo, a expressão de seu transportador.
  • DOI: 10.11606/T.41.2011.tde-26042011-153538
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Biociências
  • Data de criação/publicação: 2011-04-06
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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