Sequenciamento e caracterização de cDNAS codificando para a cadeia leve da miosina, desidrogenase láctica e poliubiquitina em Schistosoma mansoni

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Sequenciamento e caracterização de cDNAS codificando para a cadeia leve da miosina, desidrogenase láctica e poliubiquitina em Schistosoma mansoni
Autor: Renata Guerra de Sá
Vanderlei Rodrigues
Assuntos: BIOQUÍMICA
Notas: Tese (Doutorado)
Descrição: A complexidade do ciclo de vida do Schistosoma mansoni aliado ao fato deste organismo ser um dos raros trematódeos a apresentar dimorfismo sexual tem recebido muita atenção nos últimos anos. Durante o seu ciclo evolutivo, este parasita sofre profundas alterações morfológicas e bioquímicas, o que lhe permite uma perfeita adaptação a vários ambientes e hospedeiros. Dentro deste contexto, é de fundamental importância, para o entendimento destas adaptações, o conhecimento de moléculas que participam de vias metabólicas críticas para a sua sobrevivência. Além disso, a análise do genoma, utilizando bibliotecas de cDNA tem contribuído para o isolamento de vários genes e a determinação das suas seqüências têm contribuído para uma melhor compreensão da biologia deste parasita. Neste sentido, este trabalho mostra o seqüenciamento e a caracterização de três genes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA, construída com RNAm extraído de parasitas adultos. Um dos cDNAs estudados, foi o que codifica a cadeia leve da miosina-subunidade essencial, por nós denominado SmECL. O alinhamento dos resíduos de aminoácidos preditos, obtidos a partir da seqüência de nucleotídeos, revelou a existência de aminoácidos conservados que são essenciais para a função da proteína. Utilizando este cDNA como sonda molecular, também foi possível verificar a sua expressão em todas as formas de desenvolvimento do parasita, confirmar que o cDNA clonado continha uma mensagem completa e estimar a
presença deste gene em pelo menos uma cópia por genoma haplóide do parasito. Tomando por base a via glicolítica, este trabalho também mostra a seqüência completa de um cDNA codificando para a enzima lactato desidrogenase, por nós denominado SmLDH-A. Baseados em análises de hibridização, podemos sugerir que este gene apresenta-se expresso em todas formas de desenvolvimento do parasita, porém, em vermes adultos, é diferencialmente expresso. Em vermes ) adultos, os nossos resultados sugerem fortemente que, a glicose (direta ou indiretamente) parece modular tanto o processo de transcrição como a da tradução deste gene, uma vez que, um aumento na concentração de glicose no meio de cultivo dos parasitas adultos afetou tanto a expressão do gene quanto a atividade da enzima, indicando um complexo programa de regulação da expressão deste gene. Quanto a representação no genoma, os nossos resultados sugerem que o SmLDH-A apresenta pelo menos uma cópia por genoma haplóide. Finalemnte, foi seqüenciado um cDNA codificando para poliubiquitina (SmUBi). A análise da expressão mostra que este gene é expresso em todas as formas de desenvolvimento do parasita. Além disso, a avaliação da expressão deste gene em parasitas adultos sugere a existência de doffs genes com seqüências homólogas a ubiquitina, o que foi confirmado estudando o DNA genômico. Também observamos que o gene SmUbi, é induzido por estresse térmico, sugerindo assim que o promotor deste gene possa ser um membro da
família dos elementos que respondem ao choque térmico. Utilizando anticorpos específicos contra ubiquitina, foi possível identificar em extratos totals, obtidos à partir das várias faces evolutivas do Schistosoma mansoni, a existência de conjugados de proteína-ubiquitina. Além disso, em extratos totals, obtidos a partir de esquistossômulos evidenciou-se um major número de proteínas marcadas com ubiquitina em relação às outras formas de desenvolvimento do parasita. Somando-se às evidências anteriores, verificamos também que a atividade proteolítica endógena basal da via proteolítica dependente de ATPubiquitina a do proteassoma, em extrato bruto, foi significativamente estimulada após a adição de ATP a ubiquitina. Por outro lado, também identificamos nestes extratos uma atividade proteolitica sobre o peptideo sintético ) Suc-Leu-Leu-Val-Try-NHMec, evidenciando assim uma atividade semelhante a quimiotripsina. Experimentos realizados na presença de MG132, um conhecido ìnibidor da atividade peptidásica do proteassoma, mostraram 90% de inibição da proteólise exógena a 80% da endógena. Posteriormente, utilizando estes inibidores da atividade peptidásica do proteassoma em parasites adultos, mantidos in vitro a pare avaliar o desenvolvimento da esquistosomose experimental, foi possivel demonstrar uma redução significativa no número dos esquistossômulos, na carga parasitária, no número de ovos presente nas fezes destes animais a no pareamento dos vermes. Estes resultados
sugerem que uma inibição transitória do proteassoma no desenvolvimento do parasita leva à uma diminuição dos sinais patológicos associados a esquistossomose mansônica experimental
Data de criação/publicação: 2000
Formato: 220 p.
Idioma: Português

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Sequenciamento e caracterização de cDNAS codificando para a cadeia leve da miosina, desidrogenase láctica e poliubiquitina em Schistosoma mansoni

Renata Guerra de Sá Vanderlei Rodrigues

2000

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