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Subclonagem, expressão e purificação da enzima hialuronidase-1, variante 8, humana

Del Monaco De Maria, Adriana

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Ciências Farmacêuticas 2013-10-21

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Subclonagem, expressão e purificação da enzima hialuronidase-1, variante 8, humana
  • Autor: Del Monaco De Maria, Adriana
  • Orientador: Hirata, Mario Hiroyuki
  • Assuntos: Biologia Molecular; Hialuronidase; Plamídeo Sintético; Sub-Clonagem; Hyaluronidase; Molecular Biology; Sintetic Plasmid; Subcloning
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: O Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25µg por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processo
  • DOI: 10.11606/D.9.2013.tde-25032014-105024
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Ciências Farmacêuticas
  • Data de criação/publicação: 2013-10-21
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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