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Sistema peroxidase tripanotiona-dependente em Trypanosoma cruzi

Rodríguez, Jorge Alberto López

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química 2000-06-20

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Sistema peroxidase tripanotiona-dependente em Trypanosoma cruzi
  • Autor: Rodríguez, Jorge Alberto López
  • Orientador: Alves, Maria Julia Manso
  • Assuntos: Triparredoxina; Biologia Molecular; Trypanosoma Cruzi; Defesa Antioxidante; Doença De Chagas; Estresse Oxidativo; Triparredoxina Peroxidase; Trypanosoma; Tripanotiona; Antioxidant Defense; Triparredoxin Peroxidase; Triparredoxin; Oxidative Stress; Molecular Biology; Chagas Disease; Trypanothione
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Trypanosoma cruzi, causador da tripanossomíase americana, é um microrganismo exposto a uma variedade de espécies reativas de oxigênio, geradas como conseqüência do metabolismo de drogas tripanocidas, ou pelo hospedeiro como resposta fisiológica à invasão, além daqueles produzidos internamente em conseqüência dos processos oxidativos do parasita. Em qualquer circunstância, as células precisam proteger-se contra os produtos da redução parcial do oxigênio. Os tripanossomatídeos são aparentemente deficientes na defesa antioxidante. Embora possuindo uma superóxido dismutase, carecem de glutationa peroxidase e catalase, que são necessárias para a remoção do peróxido de hidrogênio. Além disso, glutationa, o maior composto sulfidrílico antioxidante em células de mamíferos, está presente em baixas concentrações nos tripanossomatídeos. No seu lugar, têm um composto sui generis, um conjugado de glutationa e de espermidina, conhecido como tripanotiona (N1, N8-bis(glutationil)espermidina), o qual junto com a tripanotiona redutase e o sistema peroxidase tripanotiona-dependente, parece estar envolvido no mecanismo de defesa antioxidante em Crithidia fasciculata. Este sistema parece existir em outros tripanossomatídeos, representando um importante alvo quimioterápico. A existência deste sistema metabólico em T. cruzi foi demonstrada inicialmente por uma baixa atividade peroxidásica tripanotiona-dependente, detectada em extratos celulares de formas epimastigotas e tripomastigotas. Imunoquimicamente, a existência deste sistema foi evidenciada ao se usar anticorpos heterólogos contra triparredoxina (Cf16) e triparredoxina peroxidase (Cf21) de C. fasciculata. Enquanto a reatividade em epimastigotas de T. cruzi é homogeneamente distribuída no citoplasma, as formas tripomastigotas apresentam uma reatividade descontínua localizada próxima à membrana plasmática. Os mesmos anticorpos policlonais foram utilizados para identificar por Western blot, as proteínas correspondentes em T. cruzi, sendo reconhecidas duas proteínas com massas moleculares aparente de 16 e 21 kDa, Tc16 e Tc21, respectivamente. Oligonucleotídeos foram então sintetizados baseados em regiões conservadas de seqüências codantes de DNA de peroxirredoxinas de tripanossomatídeos e de outros organismos e utilizados em ensaios de PCR com cDNA, amplificando-se um produto de 525 pb. Esta seqüência parcial apresentou uma homologia de 75% com o gene da triparredoxina peroxidase de C. fasciculata. No mesmo período foi depositada no GenBank (acc. n°. AJ012101) uma seqüência codante para uma proteína do tipo peroxirredoxina em T. cruzi e que apresentou uma homologia de 100% em relação à seqüência (correspondente às posições 1 a 525 de Acc. Nr. AJ012101). Utilizando a seqüência publicada, novos oligonucleotídeos correspondentes às regiões 5\' e 3\' foram desenhados, o gene putativo da triparredoxina peroxidase em T. cruzi (Tc21) foi amplificado a partir de DNA de T. cruzi por PCR, o produto clonado no vetor pET21b(+) e expresso em E.coli BL21(DE3). A proteína obtida apresentou atividade de tripanotiona peroxidase. Esta enzima, a triparredoxina peroxidase é membro de uma família de proteínas antioxidantes, denominadas de peroxirredoxinas, que são caracterizadas pela presença de dois domínios conservados - VCP, contendo as cisteínas envolvidas na catálise. Em relação à triparredoxina, apesar das várias tentativas empreendidas, o isolamento do respectivo gene foi infrutífero. No entanto, sua existência foi demonstrada por Western blot e imunofluorescência usando-se o anticorpo contra a triparredoxina de C. fasciculata. A triparredoxina de C. fasciculata é um membro da super-família das tiorredoxinas, com uma massa molecular de 16 kDa, maior que a tiorredoxina em vertebrados. Embora possuindo o motivo WCPPCR próximo à extremidade N-terminal, o qual é similar ao motivo WCGPCK(R), típico do sítio ativo das tiorredoxinas, a triparredoxina mostra uma baixa identidade em relação a estas últimas. A demonstração da existência de triparredoxina, triparredoxina peroxidase e tripanotiona redutase em T. cruzi sugere similaridade com o sistema de peroxidase descrito em C. fasciculata e que a defesa antioxidante em T. cruzi envolve um sistema enzimático mediado por tripanotiona e dependente de NADPH. As evidências disponíveis confirmam a existência do sistema peroxidase tripanotiona-dependente em T. cruzi, contrariando a afirmativa prévia da literatura que considerava a redução de peróxidos como uma reação não-enzimática. Esses resultados abrem a perspectiva de utilização do sistema como um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos.
  • DOI: 10.11606/T.46.2019.tde-07062019-101241
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química
  • Data de criação/publicação: 2000-06-20
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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