skip to main content
Idioma:
Primo Search
Clear Search Box
Search in: Busca Geral
Busca Avançada
Busca por Índices

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv citri envolvidos na interação com o substrato

Pinho, Jean Marcel Rodrigues

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química 2004-12-20

Acesso online

  • Título:
    Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv citri envolvidos na interação com o substrato
  • Autor: Pinho, Jean Marcel Rodrigues
  • Orientador: Silva, Ana Claudia Rasera da
  • Assuntos: Alfa-Amilase Recombinante; Xanthomonas (Estudo); Mutagênese Sítio-Dirigida; Modelagem Molecular; Enzimologia; Dados De Sequência Molecular; Biologia Molecular; Alfa-Amilase: Padrão De Clivagem; Alfa-Amilase: Parâmetros Cinéticos; Site-Directed Mutagenesis; Recombinant Alpha-Amylase; Molecular Sequence Data; Molecular Modeling; Molecular Biology; Alpha-Amylase: Cleavage Pattern; Enzymology; Alpha-Amylase: Kinetic Parameters; Xanthomonas (Study)
  • Descrição: Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose.
  • DOI: 10.11606/T.46.2016.tde-02092016-165134
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química
  • Data de criação/publicação: 2004-12-20
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
Links
Voltar para lista de resultados

  • Realização: ABCD-USP USP   Logos de Redes Sociais: Freepik

Buscando em bases de dados remotas. Favor aguardar.