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Structural and enzymatic features of a recombinant β-fructofuranosidase from Bifidobacterium adolescentis

Alain Eduard Monsalve Mera João Renato Carvalho Muniz

2016

Localização: IFSC - Inst. Física de São Carlos    (Te2468 )(Acessar)

  • Título:
    Structural and enzymatic features of a recombinant β-fructofuranosidase from Bifidobacterium adolescentis
  • Autor: Alain Eduard Monsalve Mera
  • João Renato Carvalho Muniz
  • Assuntos: PROTEÍNAS; CRISTALOGRAFIA; ENZIMAS; BACTÉRIAS; &Beta -Fructofuranosidase; &Beta -Frutofuranosidase; Bifidobacterium Adolescentis; Crystal Structure; Estrutura Cristalográfica; Gh32
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma β-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 Å e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas β cada e um domínio C-terminal sanduíche-β característico da família GH32; no entanto, ligado ao β-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-β (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição
    estrutural, utilizando uma β-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-β adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da β-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias
  • Data de criação/publicação: 2016
  • Formato: 92 p.
  • Idioma: Inglês
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