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Um Modelo para Estudos de Modulação da Pluripotência e Diferenciação Celular em Células-Tronco Pluripotentes

Lima, Ildercílio Mota De Souza

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto 2013-06-07

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Um Modelo para Estudos de Modulação da Pluripotência e Diferenciação Celular em Células-Tronco Pluripotentes
  • Autor: Lima, Ildercílio Mota De Souza
  • Orientador: Panepucci, Rodrigo Alexandre
  • Assuntos: Ácido Trans-Retinóico; Células-Tronco; Diferenciação Celular; Pluripotência; Ntera-2; All-Trans-Retinoic Acid; Pluripotency; Cell Differentiation; Stem Cells
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: Células pluripotentes são aquelas que possuem a capacidade de dar origem às células dos três folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma), bem como também às células germinativas. As células-tronco embrionárias (CTE) são as células pluripotentes mais conhecidas, as quais apresentam uma elevada capacidade de diferenciação celular e autorenovação. Estas propriedades tornam as CTE potenciais ferramentas para a medicina regenerativa, porém seu uso na prática clínica enfrenta várias barreiras. Neste sentido, o acúmulo de conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos na manutenção da pluripotência, levou ao desenvolvimento de técnicas capazes de induzir a pluripotência em células somáticas adultas. Na maioria das abordagens, isto se dá pela expressão ectópica de fatores de transcrição envolvidos na pluripotência (como Oct4 e Nanog). Com isto em vista, torna-se evidente que estudos que levem a um melhor entendimento destas propriedades biológicas, podem levar ao desenvolvimento desta importante área. Apesar destas inovações, os mecanismos responsáveis pela manutenção ou indução da pluripotência e da autorenovação, continuam largamente inexplorados. Neste sentido, o conjunto de técnicas referidas como High Content Screening (HCS) apresenta características fundamentais que permitiriam a interrogação sistemática e em larga-escala de fatores que possam estar influenciando nestes processos. A técnica de HCS se baseia no uso de microscopia de fluorescência em placas de 96 ou mais poços, permitindo a aquisição e a análise automatizada das imagens, de forma a quantificar alterações fenotípicas nas células. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo experimental para a avaliação funcional e em larga escala de fatores que possam influenciar a diferenciação celular. Tendo em vista a facilidade de cultivo e manuseio, a linhagem humana de células pluripotentes de carcinoma embrionário (CCE) NTera-2, foi utilizada. Para a padronização do modelo, o processo de diferenciação foi avaliado ao longo do tempo (em 2, 4 e 8 dias) na presença ou ausência de ácido transretinóico (atRA), utilizado como indutor de diferenciação celular. Para isso, os níveis transcricionais de Oct4, Nanog (marcadores da pluripotência) e de N-Caderina foram avaliados por PCR em tempo real. Finalmente, a expressão e a distribuição celular de Oct4, Nanog e da alfa-actina foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência automatizada, com o uso de anticorpos ou faloidina marcada, utilizando um sistema de HCS (Operetta, Perkin Elmer) para a análise dos resultados. A proliferação celular das células submetidas à diferenciação foi avaliada pelo ensaio do XTT. O atRA inibiu a proliferação e induziu a diferenciação; como demonstrado, respectivamente, pelos resultados do ensaio do XTT, decaimento dos níveis de Oct4 e Nanog e, concomitante aumento de N-Caderina, ao longo do tempo. Também foi observada a diferenciação espontânea da linhagem, na ausência de atRA, porém, de forma reduzida. Finalmente, as avaliações de HCS evidenciaram que, durante o processo de diferenciação, a perda da expressão nuclear de Oct4 e Nanog está associada à alteração do fenótipo celular, com a redistribuição da actina cortical e a formação das stress fibers, caracterizando o processo de transição epitélio-mesenquima (EMT), um importante mecanismo envolvido na diferenciação celular. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram a viabilidade do uso da linhagem NTera-2 como modelo para estudos futuros de HCS visando a identificação de moléculas que atuem na modulação de propriedades fundamentais das células tronco pluripotentes.
  • DOI: 10.11606/D.17.2013.tde-29082013-155854
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
  • Data de criação/publicação: 2013-06-07
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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