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Papel da NADPH oxidase durante a insulite e a lipotoxicidade: estresse oxidativo, disfunção e morte de células beta pancreáticas.

Bôas, Eloísa Aparecida Vilas

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas 2020-11-23

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Papel da NADPH oxidase durante a insulite e a lipotoxicidade: estresse oxidativo, disfunção e morte de células beta pancreáticas.
  • Autor: Bôas, Eloísa Aparecida Vilas
  • Orientador: Carpinelli, Angelo Rafael; Ortis, Fernanda
  • Assuntos: Ácido Palmítico; Lipotoxicidade; Nox2; Insulite; Estresse Oxidativo; Espécies Reativas De Oxigênio; Diabetes Tipo 2; Diabetes Tipo 1; Citocinas Pró-Inflamatórias; Células Beta Pancreáticas; Nadph Oxidase; Pancreatic Beta Cells; Pro-Inflammatory Cytokines; Reactive Oxygen Species; Type 1 Diabetes; Palmitic Acid; Oxidative Stress; Lipotoxicity; Insulitis; Type 2 Diabetes
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Notas Locais: ICB - T.5624 - Observação - Tombo versão digital
  • Descrição: As duas principais formas de diabetes mellitus (DM) apresentam etiologias distintas, porém um desfecho clínico comum, a hiperglicemia. No DM1, uma inflamação específica e persistente nas ilhotas pancreáticas (insulite) leva à disfunção e perda massiva das células beta. No DM2, o alto consumo de nutrientes e o aumento da resistência à ação periférica da insulina levam ao aumento da demanda de insulina em um contexto de exposição prolongada das células beta a altas concentrações de glicose e ácidos graxos (glicolipotoxicidade), culminando com a disfunção e perda de células beta. Em ambos os casos de DM há, portanto, uma disfunção celular progressiva. As citocinas pró-inflamatórias produzidas durante a insulite no DM1 e a glicolipoxicidade durante o DM2 contribuem para o desencadeamento do estresse de retículo endoplasmático (RE) e do aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo. Dentre todas as fontes de EROs, as NADPH oxidases (NOX) são as únicas que aparentemente produzem EROs como função principal. As EROs derivadas da NOX são importantes sinalizadoras para a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), porém também podem levar à disfunção das células beta. Apesar de muitos esforços, ainda não somos capazes de distinguir entre a produção fisiológica e patológica de EROs. Algumas limitações têm sido a utilização de sensores redox pouco específicos, que não dizem com precisão o tipo de espécie produzida ou qual o compartimento de produção, além da utilização de inibidores sem especificidade à NOX ou às suas diferentes isoformas. Como essas espécies são rapidamente removidas pelo sistema antioxidante intracelular, elas devem ser relevantes, sobretudo, em locais próximos à sua produção. Levando isso em conta, utilizamos ilhotas de camundongos expostas a condições que mimetizam o DM1 (citocinas pró-inflamatórias) ou DM2 (ácido palmítico) e avaliamos: 1) a produção estática de superóxido; 2) a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) em tempo real e em diferentes compartimentos; 3) as variações em tempo real de NAD(P)H e 4) o envolvimento de isoformas da NOX na produção de H2O2, tolerância à glicose, secreção de insulina, viabilidade celular, homeostase de cálcio e ativação do estresse de RE. Com esses experimentos mostramos, pela primeira vez, a variação temporal da produção de EROs em células beta pancreáticas nessas condições. Nossos resultados indicam um aumento de superóxido entre 2 e 8 horas após exposição às citocinas e, com um sensor redox específico (roGFP2-Orp1) expresso exclusivamente na matriz mitocondrial ou no citosol/núcleo, mostramos que o citosol/núcleo apresenta papel principal na produção de H2O2 induzida por citocinas ou ácido palmítico, com pico entre 4 e 5 horas. Mostramos também a participação da mitocôndria na produção de H2O2 em ilhotas expostas ao ácido palmítico, porém sem relevância frente às citocinas. O pico de produção de H2O2 citosólico/nuclear coincide com uma diminuição de NAD(P)H intracelular e foi completamente eliminado em ilhotas NOX2 knockout (KO). Animais NOX2 KO apresentaram melhor tolerância à glicose e suas ilhotas foram protegidas da disfunção secretória e da morte induzida por citocinas ou ácido palmítico. Curiosamente, a ausência de NOX2 piorou a homeostase de cálcio total em ilhotas expostas às citocinas, mas foi mantida em ilhotas expostas ao ácido palmítico. As citocinas e o ácido palmítico levaram à depleção do cálcio de RE, com consequente aumento no mecanismo de entrada de cálcio operada por estoque (SOCE). Em ilhotas expostas às citocinas, não observamos envolvimento claro da NOX2 no SOCE. Por outro lado, ilhotas NOX2 KO tiveram um menor SOCE após a exposição ao ácido palmítico, quando comparadas às ilhotas WT, indicando que o H2O2 citosólico possa estar envolvido na regulação do SOCE e/ou níveis de cálcio de RE nessas condições. Ilhotas NOX1 KO, mas não ilhotas NOX2 KO, foram protegidas do estresse de RE induzido por citocinas, porém não observamos envolvimento de NOX no estresse de RE induzido por ácido palmítico. Por fim, avaliamos os efeitos in vivo da ausência de NOX no pâncreas e nas células beta, após indução de DM1 via injeções de doses baixas e múltiplas de estreptozotocina em animais NOX1 KO ou NOX2 KO. Ilhotas NOX2 KO de animais diabéticos foram protegidas de alguns parâmetros deletérios encontrados normalmente no desenvolvimento de diabetes, como a diminuição na circularidade e a diminuição da marcação de insulina. Porém, a perda de NOX1 parece prejudicar a proliferação celular nas ilhotas. Fica evidente a complexidade do papel da NOX tanto na funcionalidade, quanto na sobrevivência das células beta. Propomos que a inibição da NOX2 pode funcionar como uma terapia potencial contra a disfunção precoce de células beta induzida por citocinas pró-inflamatórias e ácidos graxos, no contexto do DM1 e do DM2.
  • DOI: 10.11606/T.42.2020.tde-03012022-095722
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas
  • Data de criação/publicação: 2020-11-23
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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