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Indução da expressão da molécula indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) como terapia gênica em transplante experimental de ilhotas pancreáticas

Dellê, Humberto

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Medicina 2007-07-23

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Indução da expressão da molécula indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) como terapia gênica em transplante experimental de ilhotas pancreáticas
  • Autor: Dellê, Humberto
  • Orientador: Noronha, Irene de Lourdes
  • Assuntos: Modelos Animais; Rejeição De Enxerto; Terapia De Genes; Transplante De Ilhotas Pancreáticas; Animal Models; Gene Therapy; Graft Rejection; Islets Of Langerhans Transplantation
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: O transplante (Tx) de ilhotas pancreáticas (IP) é uma atraente alternativa para o tratamento do diabetes melito tipo 1. No entanto, para evitar a rejeição há necessidade de imunossupressão. Uma nova idéia de tolerância surge a partir do paradoxo imunológico, onde a mãe, imunologicamente competente, não rejeita o embrião durante a gravidez. Uma das hipóteses é que células da placenta expressam a molécula IDO, a qual protege o embrião do ataque imunológico materno. O objetivo do estudo foi analisar o efeito da indução da expressão da IDO em IP em transplante experimental de IP. Para tanto, as seguintes etapas de padronização foram necessárias. Etapa 1: Padronização da perfusão e digestão do tecido pancreático de rato e determinação do método para a purificação das IP, comparando-se diferentes gradientes de densidade: descontínuo de Ficoll, contínuo de Ficoll e contínuo de iodixanol. Foi demonstrado que o gradiente contínuo de iodixanol fornece maior pureza e maior número de IP íntegras e funcionais. Etapa 2: Padronização do Tx experimental de IP sob a cápsula renal para avaliação do número mínimo de IP transplantadas para reverter o diabetes induzido por estreptozotocina, definido como glicemia >300mg/Kg. Foram transplantadas entre 200 a 3.000 IP por experimento. A rejeição das IP foi analisada pela sobrevida das IP (permanência da glicemia <300mg/dL), tanto em Tx isogênico (Lewis-Lewis) como em alogênico (Sprague-Dawley-Lewis). Para reverter o diabetes foram necessárias no mínimo 2.500 IP. No transplante entre ratos isogênicos (n=6) não houve rejeição das IP. Já no transplante entre animais alogênicos (n=12), as IP apresentaram uma curta sobrevida pós-Tx (11±1 dias; p<0,01 vs. Tx isogênico). Dez dias pós-Tx, houve um grande infiltrado de macrófagos e linfócitos T no enxerto alogênico e uma diminuição significativa da expressão de insulina (p<0,001 vs. Tx isogênico). Etapa 3: Construção do vetor de expressão para IDO. A partir de RNA extraído de placenta de rata no 10º dia de gestação, foi amplificada a seqüência completa do cDNA para IDO, utilizando-se RT-PCR. Em seguida, o cDNA para IDO foi inserido em vetor de expressão (vetor-IDO). Etapa 4: Transfecção do vetor-IDO nas IP. O vetor-IDO foi introduzido nas IP através de lipofecção (Lipofectamina 2000), testando-se diferentes concentrações do vetor-IDO (0, 0,5, 1 e 10 ng/uL) e diferentes períodos de incubação (1h, 15h e 24h). A expressão de IDO nas IP foi confirmada por RT-PCR e imuno-histoquímica. A incubação com 10 ng/uL de vetor-IDO durante 24h foi eficaz para induzir a expressão de IDO nas IP, confirmada a nível de RNAm (RT-PCR) e de proteína (imuno-histoquímica). A eficiência da transfecção em nível funcional foi confirmada pela degradação de triptofano em cultura (dosagem de triptofano por HPLC). Etapa 5: Onze transplantes alogênicos (Sprague-Dawley-Lewis) com IP transfectadas com vetor-IDO foram realizados para analisar o efeito da IDO. Três animais foram sacrificados para análise de imuno-histoquímica e 8 animais foram acompanhados por 45 dias. A sobrevida das IP transfectadas com vetor-IDO foi significativamente maior comparada com a sobrevida de IP não-transfectadas (p<0,01). O estudo conclui que a expressão da IDO protege as IP aumentando a sobrevida das IP.
  • DOI: 10.11606/T.5.2007.tde-11092007-133551
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Medicina
  • Data de criação/publicação: 2007-07-23
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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