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Enzima conversora de endotelina clonagem, expressão e purificação

Paula Amaral Gurgel Garrido Edna Teruko Kimura; Emer Suavinho Ferro; Gilson S Baia; Jörg Kobarg; Cláudio S Shida; Congresso Instituto Ciências Biomédicas, IV (2. 2003 São Paulo)

Resumos São Paulo: Comissão de Pesquisa do ICB/USP

São Paulo Comissão de Pesquisa do ICB/USP 2003

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  • Título:
    Enzima conversora de endotelina clonagem, expressão e purificação
  • Autor: Paula Amaral Gurgel Garrido
  • Edna Teruko Kimura; Emer Suavinho Ferro; Gilson S Baia; Jörg Kobarg; Cláudio S Shida; Congresso Instituto Ciências Biomédicas, IV (2. 2003 São Paulo)
  • Assuntos: HISTOLOGIA
  • É parte de: Resumos São Paulo: Comissão de Pesquisa do ICB/USP
  • Notas: Disponível em CD-ROM
  • Descrição: A enzima conversora de endotelina (ECE1; EC 3.4.24.71) é uma endopeptidase da família da neprilisinas, que se caracterizam por serem proteínas integrais de membrana e por possuírem um motif típico conservado HExxH de metalopeptidases. A importância farmacológica da ECE1 esta principalmente na propriedade de converter o precursor big-endotelina no peptídeo vasoconstrictor endotelina, formado por 21 aminoácidos e produzido por células do endotélio vascular. Portanto, esse membro da família da neprilisina é um alvo terapêutico importante, por exemplo, por participarem de desordens fisiológicas nos sistemas cardiovascular e inflamatório. Inibidores potentes e seletivos da ECE1 poderão contribuir para um melhor entendimento das funções dessa enzima. O objetivo do presente trabalho é clonar, expressar e purificar a ECE1 em larga escala para determinação de sua estrutura cristalográfica. O cDNA que codifica o domínio catalítico da ECE1 de leito vascular de ratos foi amplificado por rt-PCR com base nas seqüências de DNA depositadas no GeneBank, e posteriormente subclonado em vetor plasmidial de transferência pBSV-8His para expressão da proteína correspondente. A construção pBSV-8His-ECE1 e o DNA do baculovírus BaculoGOLD (Pharmigen) foram co-transfectados em células de inseto Sf9 em cultura de células em suspensão. A proteína recombinante expressa foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel, e submetida a
    desglicosilação enzimática, a western blotting contra o anticorpo anti-His tag e ao espectro de absorção de dicroísmo circular. Esses resultados indicaram a expressão da enzima em sua forma madura, com modificações pós-traducionais e estrutura secundária onde predominam alfa-helices. Esses resultados demonstram a habilidade da metodologia utilizada para clonar e expressar a ECE1 recombinante. Assim, experimentos adicionais estão sendo conduzidos com o objetivo de expressar e purificar a ECE1 em larga escala para determinação de sua estrutura cristalográfica
  • Editor: São Paulo Comissão de Pesquisa do ICB/USP
  • Data de criação/publicação: 2003
  • Formato: Poster 90.
  • Idioma: Português
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