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Espectroscopia de correlação de fluorescência aplicada em estudos de sistemas moleculares, biológicos e celulares

Tsutae, Fernando Massayuki

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos 2016-05-24

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Espectroscopia de correlação de fluorescência aplicada em estudos de sistemas moleculares, biológicos e celulares
  • Autor: Tsutae, Fernando Massayuki
  • Orientador: Guimarães, Francisco Eduardo Gontijo
  • Assuntos: Espectroscopia De Correlação De Fluorescência; Marcadores Fluorescentes; Microscopia Confocal; Confocal Microscopy; Fluorescence Correlation Spectroscopy; Fluorescent Dyes
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma das diferentes técnicas de análise por imagens de alta resolução espacial e temporal de biomoléculas em concentrações extremamente baixas. Ela se tornou uma técnica extremamente poderosa e sensível em áreas como bioquímica e biofísica. Como uma técnica bem estabelecida, ela é utilizada para medir concentrações locais de biomoléculas, através da marcação com moléculas fluorescentes. Coeficientes de difusão e constantes cinéticas também podem ser medidos através de FCS assim como detecção de molécula única. Ela também pode dar informação precisa sobre interações de antígeno-anticorpo, ácidos nucleicos e proteínas. Através de uma combinação de marcadores de alto rendimento quântico, fontes de luz estável (lasers), detecção ultrassensível e microscopia confocal, é possível realizar medidas de FCS em volumes de fentolitros (fL) e em concentrações de nanomolar (nM) em soluções aquosas ou em células vivas. Em contraste com outras técnicas de fluorescência, a sensibilidade da FCS aumenta com a diminuição da concentração do fluoróforo marcador, porque o parâmetro de interesse não é a intensidade de emissão de fluorescência, mas sim as flutuações espontâneas da fluorescência. Durante o tempo em que a partícula ou molécula atravessa o volume de medida pode ocorrer mudanças conformacionais e reações químicas e fotofísicas que alteram as características de emissão do fluoróforo e causam flutuações no sinal detectado. Estas flutuações são então monitoradas e transformadas em uma curva de autocorrelação, por intermédio de um software comercial que emprega um modelo físico apropriado para FCS. Em nosso estudo, utilizamos um marcador comercial (ALEXA 488®) para marcar proteínas. Primeiramente utilizamos a técnica de FCS para medir concentrações extremamente baixas de marcadores fluorescentes. Também realizamos um experimento testando a influência da viscosidade do meio na difusão livre do fluoróforo, assim como as melhores condições em que temos um melhor sinal de FCS. Por fim, estudamos a difusão de proteínas marcadas (PUC II e IV) em meio aquoso (PBS) e no interior de células.
  • DOI: 10.11606/T.76.2016.tde-14102016-101124
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos
  • Data de criação/publicação: 2016-05-24
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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  • Realização: ABCD-USP USP   Logos de Redes Sociais: Freepik

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