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Determinantes estruturais da especificidade pelo substrato de CBMs (Carbohydrate Binding Modules) e suas contribuições na ação de glicosil-hidrolases

Gilvan Pessoa Furtado Richard John Ward

2013

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Furtado, Gilvan Pessoa )(Acessar)

  • Título:
    Determinantes estruturais da especificidade pelo substrato de CBMs (Carbohydrate Binding Modules) e suas contribuições na ação de glicosil-hidrolases
  • Autor: Gilvan Pessoa Furtado
  • Richard John Ward
  • Assuntos: ENZIMAS; PROTEÍNAS (ESTRUTURA); ESCHERICHIA COLI; BIOLOGIA MOLECULAR
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Enzimas que atuam na hidrólise ou modificação dos diversos tipos de carboidratos encontrados na natureza se apresentam, muitas das vezes, na forma de enzimas multifuncionais formadas por vários domínios ou módulos, onde o domínio catalítico, responsável pela atividade hidrolítica do complexo, está associado a outras proteínas acessórias que podem auxiliar na catálise ou exercer funções estruturais. Dos módulos não catalíticos, o mais conhecido e estudado são os CBMs (Carbohydrate Binding Modules) e o trabalho atual apresenta um estudo destes módulos dividido em duas partes. Na primeira, três diferentes famílias de glisosil-hidrolases (GH11, GH12 e GH16) que na natureza são constituídas somente por domínios catalíticos, foram fundidas por técnicas de biologia molecular a CBMs que possuíam maior afinidade pelo substrato da respectiva glicosil-hidrolase. Desta forma três proteínas quiméricas foram criadas e expressas de forma heteróloga em Escherichia coli, CBM11-Glucanase, CBM22-Xilanase e CBM44-Xiloglucanase. Caracterizações bioquímicas e biofísicas de cada quimera foram realizadas e comparadas com as enzimas individuais. Duas quimeras, CBM11-Glu e CBM44-Xeg, demonstraram aumentos na eficiência catalítica de 25 e 30% respectivamente e a quimera CBM22-Xil apresentou uma maior termotolerância, com tempo de meia vida superior a 90 minutos a 55°C, enquanto para xilanase nativa a meia vida foi de 8 minutos nesta temperatura. Na segunda parte do trabalho a CBM11 foi usada como modelo para o estudo da especificidade pelo substrato. Uma biblioteca de mutantes aleatórios desta CBM foi criada pela técnica de error prone PCR e expressa na superfície de bacteriófagos pela metodologia de phage display. Os fagos oriundos desta biblioteca, cada um expressando diferentes variantes da proteína, foram desafiados a se ligarem ao polissacarídeo xiloglucano, que naturalmente interage com
    baixa afinidade com a CBM11 nativa. Sete rodadas de seleção foram realizadas, consistindo na ligação, lavagem e eluição dos fagos (biopanning). Após a quinta rodada dois mutantes, Y149F/D160A e Y43N/G49D/H99L foram selecionados e a afinidade por xiloglucano e ,ß-glucano avaliada por eletroforese de afinidade que mostrou um aumento na interação de ambos os mutantes com xiloglucano e perda da afinidade por ,ß-glucano pelo mutante Y43N/G49D/H99L. Mutações pontais mostraram que a mutação Y149F é responsável pelo aumento na afinidade por ambos substratos e a mutação H99L reduz a afinidade por ,ß-glucano. Três outros mutantes, S20T, E40A/K64N e S27A/N37K/D48G/V94A foram selecionados na sexta e sétima rodada de seleção, mas não demonstraram aparente mudança de afinidade
  • Data de criação/publicação: 2013
  • Formato: 102 p Anexos.
  • Idioma: Português
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