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Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial do siri Callinectes danae aclimatado a salinidade de 15%o

Douglas Chodi Masui Francisco de Assis Leone

2006

Localização: FFCLRP - Fac. Fil. Ciên. Let. de R. Preto    (Masui, Douglas Chodi )(Acessar)

  • Título:
    Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial do siri Callinectes danae aclimatado a salinidade de 15%o
  • Autor: Douglas Chodi Masui
  • Francisco de Assis Leone
  • Assuntos: ENZIMOLOGIA; QUÍMICA
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: As propriedades bioquímicas da ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15/1000 foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33/1000 (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33/1000 por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade 'alfa' da ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15/1000 quando comparados aos animais aclimatados a 33/1000. Entretanto, proporções similares de subunidade a foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33/1000 e aclimatados a 15/1000. A estimulação da atividade ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio ('n IND. H'=1,2), com V=298,8 '+ OU -' 16,7 U/mg, com 'K
    IND. 0,5' de 174,2 '+ OU -' 9,8 'mü'M. A estimulação da atividade ATPase da ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase por íons 'Mg POT. 2+' (V= 299,16 '+ OU -' 14,06 U/mg; 'K IND. 0,5'= 767,31 '+ OU -' 36,06 'mü'M), íons 'Na POT. +' (V= 309,0 '+ OU -' 15,8 U/mg; 'K IND. 0,5'= 7,8 '+ OU -' 0,4 mM), íons 'K POT. +' (V= 300,6 '+ OU -' 15,3 U/mg; 'K IND. 0,5'= 1,63 '+ OU -' 0,08 mM) e íons 'N'H IND. 4' POT. +' (V= 345,1 '+ OU -' 19,0 U/mg;'K IND. 0,5'= 6,0 '+ OU -' 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons 'K POT. +' com atividade máxima variando de 300,6 '+ OU -' 15,3 U/mg para 514,6 '+ OU -' 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons 'N'H IND. 4' POT. +', respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon 'K POT. +' da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 '+ OU -' 0,08 mM para 0,157 '+ OU -' 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons 'K POT. +', o íon 'N'H IND. 4' POT. +' estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons 'K POT. +'. A estimulação da atividade da enzima pelo íon 'N'H IND. 4' POT. +' também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 '+ OU -' 19,0 U/mg para 516,8 '+ OU -' 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores
    de 'n IND. H' e 'K IND. 0,5' com o aumento da concentração de íons 'K POT. +'. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de 'K IND. I' de 45,09 '+ OU -' 2,5 'mü'M. O ortovanadato também inibiu atividade ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de 'K IND. I' da ordem de 1,31 '+ OU -' 0,06 'mü'M. O emprego de bafilomicina 'A IND. 1', tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, 'Ca POT. 2+'-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma 'F IND. 0''F IND. 1'-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons 'Na POT. +' sugere fortemente a presença de uma 'K POT +'-ATPase. A ('Na POT. +','K POT. +')-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 '+ OU -' 4,3 U/mg e 'K IND. M'= 1,7 '+ OU -' 0,1 mM. Já a estimulação da atividade 'K POT. +'-fosfatase da enzima por íons 'Mg POT. 2+' (V= 93,7 '+ OU -' 2,3 U/mg; 'K IND. 0,5'= 1,40 '+ OU -' 0,03 mM), 'K POT. +' (V= 94,9 '+ OU -' 3,5 U/mg; 'K IND. 0,5'= 2,9 '+ OU -' 0,1 mM) e 'N'H IND. 4' POT. +' (V= 106,2 '+ OU -' 2,2 U/mg; 'K IND. 0,5'= 9,8 '+ OU -' 0,2 mM) seguiu uma cinética
    cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade 'K POT. +'-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons 'K POT. +' mais 'N'H IND. 4' POT. +'. Os íons sódio ('K IND. I'= 22,7 '+ OU -' 1,7 mM) e ortovanadato ('K IND. I'= 28,1 '+ OU -' 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição
  • Data de criação/publicação: 2006
  • Formato: 104 p. anexos.
  • Idioma: Português

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